外泌體成分與提取方法

日期：2017-12-15 標簽：外泌體成分與提取方法

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外泌體的組成成分

外泌體主要有3大組成部分-蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)。眾所周知，外泌體的脂質(zhì)來(lái)源于細胞膜，屬于磷脂雙分子層結構，與細胞膜結構差異不大，故重點(diǎn)介紹外泌體中的蛋白與核酸。

外泌體中的蛋白可分為兩大類(lèi)，膜蛋白與膜內蛋白

膜蛋白

膜蛋白主要分兩類(lèi)，一類(lèi)是幾乎所有外泌體均含有的蛋白，這類(lèi)蛋白可作為外泌體區別于其他囊泡（EVs）的標志物如（CD9，CD63，CD81，CD326）。

另一類(lèi)是特異性膜蛋白，特定細胞分泌的外泌體上特有的。如A33（結腸上皮細胞來(lái)源）、MHC-Ⅱ、CD86(抗原提呈細胞來(lái)源-T細胞) 、乳凝集素（不成熟的樹(shù)突狀細胞）這些膜蛋白主要用于分離外泌體或分離來(lái)源于特定細胞的外泌體。

膜內蛋白

膜內蛋白主要包括熱休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90)、代謝類(lèi)的酶（GAPDH,烯醇化酶 1, 醛縮酶 1, PKM2, PGK1）、核糖體蛋白（RPS3）、信號轉導因子（黑色素瘤分化相關(guān)因子, ARF1, CDC42, ）粘附因子（MFGE8、整合素）、細胞骨架蛋白以及泛素。

核酸

 外泌體內的核酸包括DNA與RNA。在靶細胞內起作用的主要是RNA，外泌體內的RNA主要包括mRNA，microRNA，ncRNA，其中microRNA屬于功能性RNA，他可以調節細胞內RNA和蛋白的水平，從而影響細胞的形態(tài)和功能。因此，microRNA是外泌體中研究最廣泛最深入的RNA，且這些外泌體中的RNA往往與疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。下表中介紹了許多與疾病有關(guān)的外泌體lncRNA和microRNA。

外泌體分離方法

無(wú)論是正常細胞還是癌細胞都會(huì )分泌外泌體。外泌體分布相當廣泛，主要分布在血液、尿液、汗液、唾液、腦脊液、乳汁等體液系統中，我們要研究外泌體，首先要將外泌體從這些體液系統中提取出來(lái)

• 超速離心法

低轉速離心，去除細胞或其他大顆粒雜質(zhì)，然后超速離心沉降外泌體。

• 外泌體沉降法

即通過(guò)PEG或其他親水試劑，將外泌體濃縮，低速離心后收集外泌體，市面上出售的外泌體提取試劑盒均采用此種方法。

• 過(guò)濾法

一開(kāi)始通過(guò)大孔徑濾膜濾掉細胞，再通過(guò)小孔徑濾膜濾掉蛋白等雜質(zhì)，最后通過(guò)0.1um的孔過(guò)濾，得到外泌體

• 免疫磁珠法

帶有外泌體特異抗體的磁珠（如CD9,CD63，CD81，CD326）與樣本孵育，用磁鐵或離心等方法將外泌體分離出來(lái)

• 綜合法

上述幾種方法，方法一、二、三、提取的純度不夠，方法四、提取的量不夠，我們可以將這兩組方法綜合起來(lái)，先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌體，再用方法四提純外泌體。

外泌體提取后，我們要檢測我們提到的是否是外泌體，加測方法主要有流式檢測、WB檢測（檢測指標有CD9,CD63，CD81，CD326）、電鏡觀(guān)察。