3D模型驗證技術(shù)

基因組模型構建完成后，我們需要對模型進(jìn)行驗證。主要從兩個(gè)方面對模型進(jìn)行驗證，一個(gè)是模型結構進(jìn)行驗證，一個(gè)是對模型功能進(jìn)行驗證。對模型結構驗證，我們也是從兩個(gè)方面進(jìn)行驗證，一個(gè)利用DNA FISH對模型的空間定位進(jìn)行研究，一個(gè)是利用3C對模型的空間結構進(jìn)行驗證。對模型的功能驗證，我們主要利用CRISPR技術(shù)去除模型結構，觀(guān)察對應基因及細胞代謝的變化。

DNA FISH-模型空間定位驗證

DNA FISH的基本流程與RNA及蛋白FISH相似，但DNA FISH探針要求更加嚴格，且細胞內的DNA及探針均需要變性。DNA FISH是觀(guān)察細胞核中DNA分步，這需要更高放大倍數的共聚焦顯微鏡。

如下圖所示，在母本染色體中，三個(gè)基因是分開(kāi)的，在父本染色體中，3個(gè)基因經(jīng)過(guò)環(huán)形折疊在一起。

3C-模型空間結構驗證

3C的基本流程如下圖所示。染色質(zhì)先進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后酶切，連接，再進(jìn)行QPCR檢測。3C技術(shù)主要捕獲的是兩基因間的互作，因此這種技術(shù)常用來(lái)驗證基因間的互作。

下圖所描述的是基因promoter區與增強子區的互作驗證，我們可以看到FIP1L1與914kb處的增強子有互作。

CRISPR-模型功能驗證

我們利用CRISPR 技術(shù)敲掉CTCF motif，使CTCF無(wú)法結合，基因組的3D結構模型被破壞，相應基因的表達受到影響，細胞功能也可能會(huì )受到影響。CRISPR的功能是強大的，您可以根據您的需要敲除增強子，沉默子，絕緣子，甚至基因。

CTCF位點(diǎn)被定點(diǎn)敲除

酶切檢測敲除效率

PCR檢測位點(diǎn)敲除后的基因變化

位點(diǎn)敲除后的功能檢測

• 1 . 3D模型驗證技術(shù)
• 2 . 3D基因組之Hi-C技術(shù)
• 3 . 3D基因組之ChIP-seq