參與m6A RNA修飾和功能相關(guān)的蛋白

日期：2017-12-23 標簽：參與m6A,RNA修飾和功能相關(guān)的蛋白

目前的大量研究表明m6A修飾主要發(fā)生在細胞核中，而其功能發(fā)生在細胞質(zhì)中，與這個(gè)概念相一致，m6A“作者”（METTL3，METTL14，WTAP）和“消除者”FTO、ALKBH5主要存在于細胞核中，對RNA進(jìn)行甲基化修飾或者去甲基化；而大多數“閱讀者”YTHDF1、YTHDF2存在于細胞質(zhì)中，與m6A RNA的翻譯、降解等功能相關(guān)。

1、m6A RNA的“作者”---腺苷甲基轉移酶METTL3，METTL14，WTAP

m6A mRNA甲基化是由多組分甲基轉移酶復合物催化的，最初被分離為來(lái)自HeLa核提取物的約200kDa和約800kDa的亞復合物，METTL3較早被鑒定為該復合物的S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）結合組分，并且可以顯示其自身的催化功能，METTL3在真核生物中高度保守。

目前已有證據證明METTL3在m6A修飾中具有重要作用：在HeLa細胞中敲減METTL3導致總m6A水平下降約30％，并且在HepG2細胞中相同的敲低實(shí)驗可能通過(guò)激活p53介導的途徑誘導細胞凋亡；敲低METTL3降低了來(lái)自小鼠胚胎干細胞Hela細胞和HepG2細胞mRNA中的m6A峰，METTL3 / 2小鼠交配產(chǎn)生的囊胚中METTL3的基因消除導致mRNA上m6A幾乎完全耗盡，進(jìn)一步強調了METTL3在m6A修飾中的關(guān)鍵作用。

METTL14是m6A甲基轉移酶復合物的另一種活性成分，與METTL3形成穩定的雜合復合物，METTL14與METTL3緊密同源，純化的METTL14也能特異性甲基化共有的GAC基序，而METTL14的敲低也可能導致mRNA中m6A含量的降低。

生物化學(xué)表征顯示這兩種蛋白質(zhì)以1：1的化學(xué)計量比形成穩定的復合物。盡管METTL14的甲基化活性在體外略高于METTL3，但甲基轉移酶的組合導致甲基化活性顯著(zhù)增強。這種異源二聚體還顯示出對同源m6A共有序列的強烈偏好和對體外結構較少的RNA的適度偏好。更有研究表明，這兩個(gè)組分在細胞中形成復合物的甲基化活性比分開(kāi)的部分活性更高。

WTAP是體內m6A甲基轉移酶復合物的第三個(gè)關(guān)鍵組分。WTAP最初被鑒定為與Wilms腫瘤1（WT1）蛋白結合的剪接因子，對于細胞周期和早期哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要。WTAP在m6A甲基化中的重要作用首先在酵母和擬南芥中發(fā)現，分別研究其同源物Mum2和FIP37，發(fā)現它們與METTL3結合，是mRNA高效甲基化所必需的。

WTAP與METTL3和METTL14相互作用，并與METTL3-METTL14異二聚體在細胞核內共定位以參與m6A RNA甲基化，盡管WTAP單獨在體外沒(méi)有顯示任何甲基轉移酶活性，但敲除WTAP顯著(zhù)降低了細胞mRNA中的m6A峰，甚至比敲低METTL3或METTL14更顯著(zhù)。

圖2  甲基轉移酶和去甲基化酶的對m6A RNA的作用

2、m6A RNA的“消除者”---去甲基化酶FTO和ALKBH5

FTO是ALKB家族的成員。FTO是發(fā)現的第一個(gè)RNA去甲基化酶，是m6A生物學(xué)研究的一個(gè)重要突破。Fto基因最初是在缺失導致突變小鼠融合表型的4個(gè)基因中發(fā)現的。FTO最初顯示在單鏈DNA中N3-甲基胸腺嘧啶核苷和單鏈RNA中的N3-甲基尿苷在體外去甲基化;然而，體內FTO的功能仍然是未知的，直到發(fā)現FTO在體外m6A有效去甲基化RNA和DNA。

進(jìn)一步的實(shí)驗顯示HeLa和293FT細胞中FTO的沉默增加了聚腺苷酸化RNA中的總m6A水平，并且FTO的過(guò)表達降低了RNA上的m6A水平。FTO失調與肥胖，腦畸形和生長(cháng)遲緩的相關(guān)性，m6A可能在這些疾病中具有重要的調節功能。FTO作為m6A去甲基化酶的發(fā)現提示了m6A在人類(lèi)發(fā)育調節中的功能作用，為了達到揭示潛在機制的最終目標，需要大量的未來(lái)工作來(lái)鑒定FTO的生理RNA靶標并闡明這種去甲基化的功能性后果。

ALKBH5是AlkB家族的另一種蛋白質(zhì)，在mRNA和其他類(lèi)型的核糖核酸中顯示出對m6A的高效去甲基活性。與FTO不同的是，ALKBH5催化反應直接從m6A-甲基化腺苷上去除甲基，而不是氧化去甲基化。Alkbh5基因敲除的小鼠顯示睪丸中凋亡細胞顯著(zhù)增加，表明精子發(fā)生缺陷。研究發(fā)現，除了mRNA之外，其他類(lèi)型的核RNA也是ALBKH5的底物。

3、m6A RNA的“閱讀者”---m6A特異結合蛋白YTHDF1-3、eIF3、HNRNPC和HNRNPA2B1

m6A RNA甲基化和去甲基化酶的發(fā)現表明m6A修飾是動(dòng)態(tài)和可逆的，這與表觀(guān)遺傳DNA和組蛋白修飾相似。對于m6A組具有生物學(xué)功能，則需要通過(guò)特定蛋白質(zhì)的識別來(lái)完成。

可以設想m6A在RNA上的三種選擇性機制：首先，識別蛋白可以選擇性地與含m6A的RNA結合;其次，特定序列中m6A的存在可能削弱RNA與結合蛋白相互作用;第三，m6A的存在可能改變RNA的二級結構，從而改變蛋白質(zhì)-RNA相互作用。在哺乳動(dòng)物細胞中，已經(jīng)鑒定了三種宿主蛋白YTHDF1,2和3（YTHDF1-3）作為選擇性m6A結合蛋白（“閱讀者”）。 

三種YTHDF蛋白都含有保守的羧基末端YTH結構域 結合m6A和功能不清的更可變的氨基末端效應子結構域。已有證據證實(shí)哺乳動(dòng)物YTHDF蛋白優(yōu)先結合于G [G> A] m6ACU共有序列處含有m6A的RNA。

用YTHDF1-3免疫沉淀的RNA中m6A的富集進(jìn)一步支持YTHDF蛋白作為m6A特異性RNA結合蛋白的作用，RNA免疫沉淀和PAR-CLIP實(shí)驗顯示除了一些lncRNA靶標之外，大多數mRNA作為YTHDF2的靶標。許多研究表明m6A閱讀器蛋白YTHDF2識別m6ARNA并介導甲基化RNAs的降解，而YTHDF1和3則與促進(jìn)m6A的mRNA的翻譯。

圖3  YTHDC1介導m6A修飾的mRNA轉移

真核起始因子3（eIF3）是43S翻譯起始復合物的一個(gè)組成部分，最近報道eIF3與5’ UTR m6A直接結合。研究顯示，eIF3結合位點(diǎn)主要定位于mRNA的5’UTRs，這對于調節翻譯起始是重要的。YTHDF1被報道與eIF3相互作用，研究人員發(fā)現，eIF3與5’UTR m6A的結合與YTHDF1無(wú)關(guān)，從而支持eIF3能夠直接結合m6A。

HNRNPC是已知參與mRNA前體加工的豐富的核內RNA結合蛋白，進(jìn)一步的研究顯示m6A對HNRNPC-RNA結合的調節影響靶轉錄物的豐度和選擇性剪接。

HNRNPA家族的另一個(gè)成員HNRNPA2B1的結合位點(diǎn)中RGAC元件的高度富集，表明HNRNPA2B1是m6A閱讀者候選者。進(jìn)一步的研究表明，與背景缺失相比，HNRNPA2B1交聯(lián)誘導的缺失與m6A峰重疊20倍，這支持HNRNPA2B1作為m6A閱讀器直接結合m6A共有序列的子集。此外，HNRNPA2B1與作為pri-miRNA微處理器復合物的組分的DGCR8蛋白相互作用，并促進(jìn)pri-miRNA的加工。

參考文獻：

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