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項目名稱(chēng)：染色質(zhì)免疫共沉淀測序 ChIP-Seq 結題報告
所屬分類(lèi)：生物信息學(xué)分析-報告解讀
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技術(shù)服務(wù)描述
染色質(zhì)免疫共沉淀測序 ChIP-Seq 結題報告
生信部
2020年08月25日
項目信息
合同編號：XXX-2020-01-01-01
客戶(hù)姓名：XXX
客戶(hù)單位：X X X X X X
1. 工作流程
染色體免疫共沉淀（ChIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 DNA 的體內相互作用的經(jīng)典實(shí)驗技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結合的基因組 DNA 片段也富集下來(lái)。通過(guò)與高通量測序技術(shù)的結合，對 ChIP 后的DNA 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析， 從全基因組范圍內尋找目的蛋白的 DNA 結合位點(diǎn)，以高效率的測序手段得到高通量的數據結果。
1.1. ChIP 免疫沉淀實(shí)驗流程
目前主要有兩種不同的ChIP 實(shí)驗方法，大致流程如下（以細胞樣品的處理過(guò)程為例）：
Cross-liking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP)
準備足量的新鮮細胞，每個(gè)IP約4x106個(gè)細胞，用新鮮的1%的甲醛處理細胞，進(jìn)行細胞交聯(lián)。
125mM的甘氨酸終止交聯(lián)，收集細胞。
超聲或酶解打斷染色質(zhì)，將基因組 DNA 打斷至 100-500bp。
將抗體（一般為1～5ug）與染色質(zhì)片段4℃孵育過(guò)夜。
加入proteinA/G beads進(jìn)行4℃孵育4-6小時(shí)。
Proteinase K 解交連。
酚氯仿或DNA提取試劑盒提取DNA
QPCR 檢測或建庫測序
1.2. ChIP Sequencing 文庫構建流程
用qubit 對ChIP片段進(jìn)行定量檢測
補齊片段末端，并在3’末端加A尾
添加Adapter
0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter
文庫PCR擴增
1XAMPure beads 去掉多余的primer
qPCR測定文庫濃度
Agilent 2100測定文庫片段大小
1.3. 生物信息分析流程
將測序結果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續標準信息分析及個(gè)性化分析。信息分析流程如下：
2. 數據結果及生物信息分析
2.1. ChIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結果
文庫片段質(zhì)檢，ChIP文庫的染色質(zhì)片段在100-500bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應該分布在250-700bp之間為最好。
Fragment Analyzer （FA）毛細管電泳檢測：
檢測結果匯總：（以下結果中文庫大小為 FA 判定結果）
2.2. 測序數據質(zhì)量控制
對原始測序數據及去除接頭后的可用數據進(jìn)行質(zhì)量評估。
具體的qc報告見(jiàn)：
2.3. Reads 在全基因組的可視化分布
使用 IGV 軟件對 Reads 進(jìn)行可視化查看，可以查看全基因組任何感興趣位置的 reads 富集情況，示例如下：
IGV 的安裝使用參考：http://software.broadinstitute.org/software/igv/
可視化操作步驟依次是：
在軟件的 Genome 選項，基因參考序列 hg38 ；
在軟件的 File 選項，上傳 要查看染色體 bigwig 文件；
以上文件上傳后可查看該染色體任意位置的基因信息及 reads 富集情況。
結果文件 ：
2.4. 全基因組 Reads 富集峰 Peak 鑒定
采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS 在全基因范圍進(jìn)行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。
圖1 全基因組 Reads 富集峰
結果文件：
Results/JFY.peakanno.csv
Results/2.4.peak_scan/JFY.covplot.pdf
2.5. Reads 在 TSS 近端富集強度分析
TSS 轉錄起始位點(diǎn)近端（0-3kb）與特定的基因轉錄調控功能有關(guān)，統計 reads 在TSS 近端的分布情況。
圖 2 reads 在 TSS 近端富集強度的分布（熱圖分布）
圖 3 reads 在 TSS 近端富集強度的分布（峰圖分布）
結果文件：
Results/2.5.tss_near/JFY.tagheatmap.pdf
Results/2.5.tss_near/JFY.plotavgprof.pdf
2.6. Reads 在 TSS 近端及遠端富集強度分析
TSS 轉錄起始位點(diǎn)近端（0-3kb）及遠端（10kb以上）的 reads 分布與特定的基因轉錄調控功能有關(guān)，統計 reads 在TSS 近端及遠端的分布情況。
圖4 reads 在 TSS 近端及遠端富集強度的分布
結果文件：
2.7. Peak 在基因組上的分布
將 Peak 根據位置信息進(jìn)行基因組注釋基因結構元件，分別統計 Peak 在結構元件（intergenic region、upstream 5K、5`UTR、exon、intron，3’UTR、downstream5k）的數目，并根據其在各個(gè)元件上的富集程度，繪制分布特征。
Peak 在基因結構元件上的分布特征：
圖5 Peak 在基因結構元件上的分布
圖6 Peak 在基因結構元件上的分布比例
Peak 在各基因結構元件上的交叉分布特征：
圖7 Peak 在基因結構元件上的交叉分布（upsetplot）
圖8 Peak 在基因結構元件上的交叉分布（vennpie）
結果文件：
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnobar.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnopie.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnoupset.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnovinnpie.pdf
2.8. Peak 基因注釋與 GO 功能分析
將 Peak 注釋到基因promoter區，并對 Peak 相關(guān)基因進(jìn)行GO 功能分析，并按照基因功能進(jìn)行聚類(lèi)分析。y軸為基因的功能聚類(lèi)，x軸為基因count數，顏色為校正p值。
圖9 Peak 相關(guān)基因的GO 功能富集分析（條形圖）
圖10 Peak 相關(guān)基因的 GO 功能富集分析（氣泡圖）
結果文件：
Results/2.8.go/JFY.ego_ALL.csv
Results/2.8.go/JFY.GO-barplot.pdf
Results/2.8.go/JFY.GO-dotplot.pdf
2.9. Peak 基因注釋與 KEGG 通路分析
將 Peak 注釋到基因promoter，并對 Peak 相關(guān)基因進(jìn)行GO 功能分析，并按照基因功能進(jìn)行聚類(lèi)分析。y軸為基因的功能聚類(lèi)，氣泡大小為基因count數，顏色為校正p值。
Pathway1中對peaks進(jìn)行基因注釋?zhuān)瑑H采用臨近基因注釋。
Pathway2中對peaks進(jìn)行基因注釋?zhuān)枰紤]多個(gè)因素，包括注釋基因的外顯子/內含子，promoter區，也包括peaks兩側可能包含順式調控元件的區域。
Pathway1:
圖11 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（條形圖）
圖12 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）
Pathway2:
圖13 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（條形圖）
圖14 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）
結果文件：
Results/2.9.kegg/JFY.KEGG**.csv
Results/2.9.kegg/JFY.pathway**.pdf
2.10. Peak 區域 Motif 分析
用 Tomtom 軟件對 Peak 區域鑒定 motif 序列；并將得到的 motif 序列與 JASPAR 數據庫（JASPAR CORE 2016 database）進(jìn)行比對，鑒定已知的 motif。
Tomtom 結果示例：
結果文件：
Results/2.10.motif/homerResults.html
Results/2.10.motif/knownResults.html
附 錄
關(guān)于賽誠生物
廣州賽誠生物科技有限公司是一家專(zhuān)注于科研基礎實(shí)驗服務(wù)及基因測序相關(guān)服務(wù)的生物技術(shù)公司。公司已有成熟的ChIP-seq，RNA-seq，甲基化及各種文庫構建服務(wù)流程，具有豐富的文庫構建和測序分析經(jīng)驗。同時(shí)，公司也開(kāi)發(fā)多項前沿的實(shí)驗技術(shù)，現已形成完善的ATAC-seq，CUT&TAG-seq體系。
除此之外，在基礎科研服務(wù)方面，我們也有巨大優(yōu)勢。傳統優(yōu)勢服務(wù)包括RNA pull down，DNA pull down，RIP，co-IP，細胞功能，流式檢測，FISH等。最近剛剛興起的ChIRP實(shí)驗已成為我們的主流產(chǎn)品，他可以同時(shí)檢測DNA、RNA、蛋白三者互作。
因此，我么擁有一支專(zhuān)注以“表觀(guān)組學(xué)”為核心的醫學(xué)轉化技術(shù)服務(wù)團隊，團隊豐富的的科研經(jīng)驗涵蓋了表觀(guān)基因組學(xué)和基因組學(xué)中的各個(gè)方面，對多個(gè)組學(xué)的數據分析和挖掘有著(zhù)豐富的 經(jīng)驗和全面的理解，比如：基因組修飾、染色質(zhì)調控、基因表達調控、基因組變異等，我們 致力于提供領(lǐng)先的個(gè)性化的表觀(guān)組學(xué)為核心的多組學(xué)整體解決方案。
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